离心就是利用甩干机转子高速旋转产生的强大的离心力,加快液体中颗粒的沉降速度,把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。甩干机是利用离心力,分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中各组分的机械。
甩干机主要用于将悬浮液中的固体颗粒与液体分开;或将乳浊液中两种密度不同,又互不相溶的液体分开(例如从牛奶中分离出奶油);它也可用于排除湿固体中的液体,例如用洗衣机甩干湿衣服;特殊的超速管式分离机还可分离不同密度的气体混合物;利用不同密度或粒度的固体颗粒在液体中沉降速度不同的特点,有的沉降甩干机还可对固体颗粒按密度或粒度进行分级。
甩干机大量应用于化工、石油、食品、制药、选矿、煤炭、水处理和船舶等部门。
中国古代,人们用绳索的一端系住陶罐,手握绳索的另一端,旋转甩动陶罐,产生离心力挤压出陶罐中蜂蜜,这就是离心分离原理的早期应用。
工业甩干机诞生于欧洲,比如19世纪中叶,先后出现纺织品脱水用的三足式甩干机,和制糖厂分离结晶砂糖用的上悬式甩干机。这些最早的甩干机都是间歇操作和人工排渣的。
由于卸渣机构的改进,20世纪30年代出现了连续操作的甩干机,间歇操作甩干机也因实现了自动控制而得到发展。
工业用甩干机按结构和分离要求,可分为过滤甩干机、沉降甩干机和分离机三类。
甩干机有一个绕本身轴线高速旋转的圆筒,称为转鼓,通常由电动机驱动。悬浮液(或乳浊液)加入转鼓后,被迅速带动与转鼓同速旋转,在离心力作用下各组分分离,并分别排出。通常,转鼓转速越高,分离效果也越好。
离心分离机的作用原理有离心过滤和离心沉降两种。离心过滤是使悬浮液在离心力场下产生的离心压力,作用在过滤介质上,使液体通过过滤介质成为滤液,而固体颗粒被截留在过滤介质表面,从而实现液-固分离;离心沉降是利用悬浮液(或乳浊液)密度不同的各组分在离心力场中迅速沉降分层的原理,实现液-固(或液-液)分离。
还有一类实验分析用的分离机,可进行液体澄清和固体颗粒富集,或液-液分离,这类分离机有常压、真空、冷冻条件下操作的不同结构型式。
衡量离心分离机分离性能的重要指标是分离因数。它表示被分离物料在转鼓内所受的离心力与其重力的比值,分离因数越大,通常分离也越迅速,分离效果越好。工业用离心分离机的分离因数一般为100~20000,超速管式分离机的分离因数可高达62000,分析用超速分离机的分离因数最高达610000。决定离心分离机处理能力的另一因素是转鼓的工作面积,工作面积大处理能力也大。
选择甩干机须根据悬浮液(或乳浊液)中固体颗粒的大小和浓度、固体与液体(或两种液体)的密度差、液体粘度、滤渣(或沉渣)的特性,以及分离的要求等进行综合分析,满足对滤渣(沉渣)含湿量和滤液(分离液)澄清度的要求,初步选择采用哪一类离心分离机。然后按处理量和对操作的自动化要求,确定甩干机的类型和规格,最后经实际试验验证。
甩干机主要构造类型
1. 制备性甩干机可分为三类:
⑴ 普通甩干机:最大转速6000 rpm左右,最大相对离心力近6000×g,容量为几十毫升至几升,分离形式是固液沉降分离,转子有角式和外摆式,其转速不能严格控制,通常不带冷冻系统,于室温下操作,用于收集易沉降的大颗粒物质,如红血球、酵母细胞等。这种甩干机多用交流整流子电动机驱动,电机的碳刷易磨损,转速是用电压调压器调节,起动电流大,速度升降不均匀,一般转头是置于一个硬质钢轴上,因此精确地平衡离心管及内容物就极为重要,否则会损坏甩干机。
⑵ 高速冷冻
甩干机:最大转速为20000~25000rpm(r/min),最大相对离心力为89000×g,最大容量可达3升,分离形式也是固液沉降分离,转头配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统,以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量,离心室的温度可以调节和维持在0~40C,转速、温度和时间都可以严格准确地控制,并有指针或数字显示,通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作,但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。
⑶ 超速甩干机:转速可达50000~80000 rpm,相对离心力最大可达510000×g,最著名的生产厂商有美国的贝克曼公司和日本的日立公司等,离心容量由几十毫升至2升,分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离,离心管平衡允许的误差要小于0.1克。超速甩干机的出现,使生物科学的研究领域有了新的扩展,它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离,还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。
超速甩干机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。超速甩干机的驱动装置是由水冷或风冷电动机通过精密齿轮箱或皮带变速,或直接用变频感应电机驱动,并由微机进行控制,由于驱动轴的直径较细,因而在旋转时此细轴可有一定的弹性弯曲,以适应转头轻度的不平衡,而不致于引起震动或转轴损伤,除速度控制系统外,还有一个过速保护系统,以防止转速超过转头最大规定转速而引起转头的撕裂或爆炸,为此,离心腔用能承受此种爆炸的装甲钢板密闭。
2. 转头:
⑴ 角式转头:角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完整的金属制成的,其上有4~12个装离心管用的机制孔穴,即离心管腔,孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在20~40度之间,角度越大沉降越结实,分离效果越好。这种转头的优点是具有较大的容量,且重心低,运转平衡,寿命较长,颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管,然后再沿管壁滑向管底,因此管的一侧就会出现颗粒沉积,此现象称为“壁效应”,壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱,影响分离效果。
⑵ 荡平式转头:这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶(离心套管)构成。当转头静止时,吊桶垂直悬挂,当转头转速达到每分钟200到800转时,吊桶荡至水平位置,这种转头最适合做密度梯度区带离心,其优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管中,离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴,而不像角式转头中样品沉淀物的界面与离心管成一定角度,因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。其缺点是颗粒沉降距离长,离心所需时间也长。
⑶ 区带转头:区带转头无离心管,主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成,转子桶中装有十字型隔板装置,把桶内分隔成四个或多个扇形小室,隔板内有导管,梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入,通过这些导管分布到转子四周,转头内的隔板可保持样品带和梯度介质的稳定。沉降的样品颗粒在区带转头中的沉降情况不同于角式和外摆式转头,在径向的散射离心力作用下,颗粒的沉降距离不变,因此区带转头的“壁效应”极小,可以避免区带和沉降颗粒的紊乱,分离效果好,而且还有转速高,容量大,回收梯度容易和不影响分辨率的优点,使超离心用于制备和工业生产成为可能。区带转头的缺点是样品和介质直接接触转头,耐腐蚀要求高,操作复杂。
3. 离心管:
离心管主要用塑料和不锈钢制成,塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE),聚碳酸酯(PC),聚丙烯(PP)等,其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明(或半透明),硬度小,可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形,抗有机溶剂腐蚀性差,使用寿命短。
不锈钢管强度大,不变形,能抗热,抗冻,抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品,如强酸、强碱等。
塑料离心管都有管盖,离心前管盖必须盖严,倒置不漏液。管盖有三种作用:
①防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时,这点尤其重要。②防止样
品挥发。③支持离心管,防止离心管变形。
4. 分析性甩干机:
分析性甩干机使用了特殊设计的转头和光学检测系统,以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。从而确定其物理性质。
分析性超速甩干机的转头是椭圆形的,以避免应力集中于孔处。此转头通过一个有柔性的轴联接到一个高速的驱动装置上,转头在一个冷冻的和真空的腔中旋转,转头上有2~6个装离心杯的小室,离心杯是扇形石英的,可以上下透光,甩干机中装有一个光学系统,在整个离心期间都能通过紫外吸收或折射率的变化监测离心杯中沉降着的物质,在预定的期间可以拍摄沉降物质的照片,在分析离心杯中物质沉降情况时,在重颗粒和轻颗粒之间形成的界面就像一个折射的透镜,结果在检测系统的照像底板上产生了一个“峰”,由于沉降不断进行,界面向前推进,因此峰也移动,从峰移动的速度可以计算出样品颗粒的沉降速度。
制备性超速离心的分离方法:
1. 差速沉降离心法:
这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心,使沉降速度不同的颗粒,在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。
差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时,在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀,分出的上清液在加大转速下再进行离心,又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液,如此多次离心处理,即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的,仍杂有其它成分,需经过2~3次的再悬浮和再离心,才能得到较纯的颗粒。
此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒,其优点是:操作简易,离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开,并可使用容量较大的角式转子。缺点是:须多次离心,沉淀中有夹带,分离效果差,不能一次得到纯颗粒,沉淀于管底的颗粒受挤压,容易变性失活。
2. 密度梯度区带离心法(简称区带离心法):
区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡,在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法。此法的优点是:①分离效果好,可一次获得较纯颗粒;②适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒;③颗粒不会挤压变形,能保持颗粒活性,并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
此法的缺点是:①离心时间较长;②需要制备惰性梯度介质溶液;③操作严格,不易掌握。
密度梯度区带离心法又可分为两种:
(1)差速区带离心法:当不同的颗粒间存在沉降速度差时(不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差)。在一定的离心力作用下,颗粒各自以一定的速度沉降,在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒(20% 的沉降系数差或更少)或分子量相差3倍的蛋白质,与颗粒的密度无关,大小相同,密度不同的颗粒(如线粒体,溶酶体等)不能用此法分离。
离心管先装好密度梯度介质溶液,样品液加在梯度介质的液面上,离心时,由于离心力的作用,颗粒离开原样品层,按不同沉降速度向管底沉降,离心一定时间后,沉降的颗粒逐渐分开,最后形成一系列界面清楚的不连续区带,沉降系数越大,往下沉降越快,所呈现的区带也越低,离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束,样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液,其最大密度和浓度可达1.28 kg/cm3和60%。
此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间
(2)等密度区带离心法:离心管中预先放置好梯度介质,样品加在梯度液面上,或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管,通过离心形成梯度,这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。
离心时,样品的不同颗粒向上浮起,一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上,形成几条不同的区带,这就是等密度离心法。体系到达平衡状态后,再延长离心时间和提高转速已无意义,处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响,提高转速可以缩短达到平衡的时间,离心所需时间以最小颗粒到达等密度点(即平衡点)的时间为基准,有时长达数日。
等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差,密度差越大,分离效果越好,与颗粒大小和形状无关,但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。
等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CSCl,其密度可达1.7 g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等,也可以分离复合蛋白质,但简单蛋白质不适用。
(1) 用注射器和滴管由离心管上部吸出。
(2) 有针刺穿离心管底部滴出。
(3) 用针刺穿离心管区带部份的管壁,把样品区带抽出。
(4)用一根细管插入离心管底,泵入超过梯度介质最大密度的取代液,将样品和梯度介质压出,用自动部分收集器收集。